第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院全軍腫瘤研究所 孫建國

Livin 是近年來發(fā)現(xiàn)的人類凋亡抑制蛋白家族的新成員，存在同基因不同剪切的兩種異構(gòu)體：Livinα和Livinβ，二者不僅抗凋亡生物學(xué)功能有差異，而且具有不同的組織表達(dá)譜，在體內(nèi)有復(fù)雜的作用機(jī)制。Livin 在人正常肺組織及癌旁組織中不表達(dá)或低表達(dá)，卻在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）組織中激活表達(dá)，并且經(jīng)過化療的患者Livin 表達(dá)水平明顯升高，這可能是臨床上肺癌發(fā)生耐藥的機(jī)制之一。利用RNA 干擾（RNAi）技術(shù)阻斷Livin 基因表達(dá)，可望成為逆轉(zhuǎn)肺腺癌細(xì)胞化療抗性的良好策略。

分別設(shè)計(jì)針對(duì)Livinα＋β、Livinα和Livinβ的siRNA 作用位點(diǎn)，分子克隆法構(gòu)建小干擾RNA（siRNA）表達(dá)載體，電穿孔法轉(zhuǎn)染SPC-A1 細(xì)胞及G418 抗性篩選后，分別建立Livin 異構(gòu)體特異性基因沉默體系pSilencer-Livinα＋β、pSilencer-Livinα和pSilencer-Livinβ。體外實(shí)驗(yàn)用甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法，根據(jù)細(xì)胞存活率繪制濃度效應(yīng)曲線，確定半數(shù)抑制濃度（IC50），研究Livin 基因沉默后SPC-A1 細(xì)胞對(duì)氟脲嘧啶（5-FU）、甲氨喋呤（MTX）、環(huán)磷酰胺（CTX）、順鉑（DDP）、卡鉑（CBP）、多柔比星（ADM）、表柔比星（EPI）、足葉乙甙（VP16）、替尼泊甙（VM-26）和長春新堿（VCR）等化療藥物的敏感性改變；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)利用荷瘤裸鼠模型，腹腔注射順鉑，根據(jù)化療前后腫瘤體積變化計(jì)算腫瘤抑制率，研究Livin 基因沉默后荷瘤小鼠對(duì)順鉑的敏感性改變。

經(jīng)酶切鑒定和測序驗(yàn)證，分別獲得針對(duì)Livinα＋β、Livinα和Livinβ的siRNA 重組載體，經(jīng)基因轉(zhuǎn)染及G418 篩選后獲得穩(wěn)定克隆，其中pSilencer-Livinα＋β和pSilencer-Livinβ的沉默效率達(dá)80%，pSilencer-Livinα的沉默效率約為60%。體外實(shí)驗(yàn)，IC50 分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)不同化療藥物敏感性較對(duì)照組細(xì)胞明顯增強(qiáng)，其中，pSilencer-Livinα＋β組細(xì)胞對(duì)幾乎所有的化療藥物表現(xiàn)為敏感性增加（P＜0.01）；pSilencer-Livinα組細(xì)胞具有相似的效應(yīng)，對(duì)多種化療藥物如MTX、CTX、CDDP、CBP、ADM、EPI 以及VCR 表現(xiàn)為增敏效應(yīng)（P＜0.05）；而pSilencer-Livinβ組細(xì)胞則對(duì)VP16 和VM26兩種化療藥物表現(xiàn)出特有的增敏作用（P＜0.05）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組小鼠腫瘤生長潛伏期為5～6 天，實(shí)驗(yàn)組小鼠生長潛伏期為7～8 天，當(dāng)腫瘤長至8～10mm 時(shí)，給以腹腔內(nèi)注射DDP，各組荷瘤裸鼠在給予化療藥物后第5 天、第10 天和第15 天移植腫瘤體積隨時(shí)間延伸而逐漸縮小，pSilencer-control 組腫瘤體積縮小最慢，pSilencer-Livinα＋β組腫瘤體積縮小最快，pSilencer-Livinα組與之接近，與pSilencer-control 組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而pSilencer-Livinβ組腫瘤體積稍大，但仍然顯著小于對(duì)照組（P＜0.05）。pSilencer-Livinα＋β組，pSilencer-Livinα組和pSilencer-Livinβ組抑瘤率分別為146.1%、130.7%、110.5%。

實(shí)驗(yàn)表明，Livin 異構(gòu)體尤其是Livinα＋β可作為肺癌細(xì)胞化療增敏的分子靶點(diǎn)，其基因沉默有望成為肺腺癌基因治療新手段。