復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科 白春學(xué)教授

     肺癌是目前世界上最常見的實(shí)體瘤和最常見的癌癥死亡原因，盡管有多種第三代化療藥物投入臨床使用，但經(jīng)手術(shù)、放療和化療等綜合治療后，其5 年生存率仍低于15%，迫切需要尋找新的治療手段和治療靶點(diǎn)。腫瘤分子靶向治療（molecular targeted therapy）利用腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞間分子生物學(xué)上的差異，采用阻斷信號傳導(dǎo)通路、封閉受體、抑制血管生成等方法作用于腫瘤細(xì)胞特定的靶點(diǎn)，特異性地抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)其凋亡。由于作用靶點(diǎn)的特異性，分子靶向治療比傳統(tǒng)化療具有更高的選擇性，毒副作用更小。目前，肺癌分子靶向治療藥物主要包括細(xì)胞生長因子受體抑制劑、血管生成抑制劑及信號傳導(dǎo)抑制劑等。

    一、以表皮生長因子受體（EGFR）為靶點(diǎn)的治療 

     由于腫瘤細(xì)胞的EGFR 及其下游信號傳導(dǎo)途徑調(diào)控失常，相當(dāng)部分的腫瘤細(xì)胞存在EGFR 的過度表達(dá)并與與腫瘤細(xì)胞的惡性行為密切相關(guān)。約40%～85% NSCLC 患者肺癌組織標(biāo)本中檢測到EGFR表達(dá)或高表達(dá)，高表達(dá)EGFR 者病變進(jìn)展較快、放化療不敏感且預(yù)后差。針對EGFR 所開發(fā)并進(jìn)入臨床研究的分子靶向藥物主要分兩類：（1）EGFR 酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKIs），抑制EGFR 胞內(nèi)區(qū)酪氨酸激酶活性；（2）人工合成的單克隆抗體（MAb），與EGFR 胞外區(qū)結(jié)合，阻斷依賴與配體的EGFR 活化。上述藥物通過不同途徑阻斷EGFR 介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，提高其對放化療的敏感性。

     （一）EGFR 酪氨酸激酶抑制劑 <br> EGFR-TKIs 是一類能作用于細(xì)胞內(nèi)表皮生長因子受體酪氨酸激酶區(qū)的小分子藥物，能抑制酪氨酸激酶磷酸化和下游信號傳導(dǎo)，目前應(yīng)用于臨床的有吉非替尼（gefitinib，ZD-1839，商品名：Iressa） 和厄洛替尼（erlotinib，商品名：Tarceva）。

    1．吉非替尼：吉非替尼是第一個(gè)口服EGFR-TKI，于2002 年6 月在日本上市，2005 年2 月26日正式在我國上市，目前用于鉑類和紫杉醇化療失敗的晚期NSCLC 患者。它屬于苯胺喹唑啉類小分子化合物，通過與ATP 競爭細(xì)胞內(nèi)EGFR 的ATP 結(jié)合位點(diǎn)來抑制EGFR 胞內(nèi)區(qū)酪氨酸激酶（TK）磷酸化、阻斷酪氨酸激酶活性，阻斷EGFR 下游信號傳導(dǎo)而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。 <br> 在2 項(xiàng)隨機(jī)、雙盲、多中心Ⅱ期臨床研究（IDEALⅠ和IDEALⅡ）中，共評價(jià)426 例使用含鉑類和/或多西紫杉醇方案化療失敗的NSCLC 晚期患者，有效率達(dá)8.8%～19%，癥狀緩解率達(dá)35%～43%。在2 項(xiàng)吉非替尼聯(lián)合化療一線治療（吉西他賓＋順鉑或紫杉醇＋卡鉑）NSCLC 的大型、隨機(jī)、多中心Ⅲ期臨床研究（INTACT1 和INTACT2）中，共分析2130 例晚期NSCLC 患者，結(jié)果顯示吉非替尼與化療合用并不能增加療效。評估吉非替尼是否延長肺癌患者生存期（ISEL）的Ⅲ期臨床研究結(jié)果顯示，與安慰劑比較該藥在延長患者生存期方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但吉非替尼對東方人群或從未吸煙的人可明顯延長生存期。EGFR 基因突變對吉非替尼療效相關(guān)，中國臺灣NSCLC 中EGFR 基因突變率為38%，日本為32%，而美國僅為2%～10%，這種差異有助于從一定程度上解釋療效的差異；但新近研究表明即使在EGFR 基因突變者中也存在大量耐藥病例。

    Shah 等認(rèn)為下列因素能增加吉非替尼的敏感性，從未吸煙者、病理為支氣管肺泡癌、女性、出生東亞。另有研究表明，使用免疫熒光原位雜交法（FISH）測定EGFR 基因拷貝數(shù)增加與患者對吉非替尼治療的反應(yīng)、腫瘤進(jìn)展時(shí)間和生存期密切相關(guān)，提示FISH 法測定EGFR 基因拷貝數(shù)是預(yù)測NSCLC患者使用吉非替尼療效的較好分子指標(biāo)。

    2．厄洛替尼：厄洛替尼是另一種針對EGFR 的小分子TKI，與吉非替尼的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制相似，2004 年11 月被美國FDA 批準(zhǔn)用于NSCLC 治療。一項(xiàng)NSCLC 二線和三線治療的Ⅲ期臨床試驗(yàn)中，731 例NSCLC 患者按2：1 比例隨機(jī)進(jìn)行厄洛替尼（150mg/日）或安慰劑治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)厄洛替尼組總生存期為6.7 個(gè)月，較對照組4.7 個(gè)月顯著延長，同時(shí)厄洛替尼組生存質(zhì)量明顯高于對照組。其中對293 例患者EGFR 表達(dá)進(jìn)行檢測結(jié)果表明，發(fā)現(xiàn)它能顯著延長EGFR 陽性患者的生存期，而對EGFR陰性患者無明顯作用。這是第一個(gè)證實(shí)在化療后使用EGFR-TKI 能延長NSCLC 患者生存期的臨床隨機(jī)試驗(yàn)，并且證實(shí)不吸煙、女性、腺癌患者對厄洛替尼治療更敏感。

    與吉非替尼類似，厄洛替尼治療最常見的不良反應(yīng)也是皮疹和腹瀉，最嚴(yán)重不良反應(yīng)是間質(zhì)性肺疾病（ILD），其發(fā)生率約0.8%。如果出現(xiàn)ILD，應(yīng)中斷厄洛替尼治療，并應(yīng)采取相應(yīng)的治療措施。厄洛替尼治療后出現(xiàn)皮疹的患者腫瘤緩解率較高、生存期較長，但這一點(diǎn)在吉非替尼臨床研究中尚存在爭議。 <br> （二）抗EGFR 單克隆抗體（MAb）

    西妥昔單抗（Cetuximab，商品名：Erbitus） 是人/鼠源嵌合的EGFR 單克隆抗體，作用于腫瘤細(xì)胞EGFR 的細(xì)胞膜外配體結(jié)合區(qū)，可阻止EGFR 與其配體結(jié)合。臨床前實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，西妥昔單抗可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成及促進(jìn)凋亡等機(jī)制提高放化療的效果。Ⅰ期臨床研究顯示西妥昔單抗200-400mg/m2 單用或與化療聯(lián)合安全性好。Hanna 等報(bào)道的一項(xiàng)西妥昔單抗單藥治療復(fù)治NSCLC的研究中，可評價(jià)病例58 例，有效率4.5%、疾病控制率35%，中位生存期9.6 月，半年和1 年生存率分別為64%和39%，最常見的毒性反應(yīng)是皮疹（77%）。Rosell 等評價(jià)了西妥昔單抗聯(lián)合化療（諾維本＋順鉑）治療初治NSCLC 的療效，86 例患者入組，92%為IV 期，加用西妥昔單抗組與未加用組總緩解率為31.7% 比20%，疾病進(jìn)展時(shí)間為4.7 個(gè)月比 4.2 個(gè)月，中位生存期為8.3 個(gè)月比 7.0 個(gè)月，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此西妥昔單抗聯(lián)合化療和放療在治療NSCLC 中的價(jià)值，仍需大樣本臨床研究進(jìn)一步證實(shí)。 

     ABX-EGF 是一個(gè)高親和力的、完全人源化的抗EGFR 單克隆IgG2 抗體。Crawford 等進(jìn)行了一項(xiàng)ABX-EGF 聯(lián)合紫杉醇＋卡鉑方案治療IIIB/IV 期、EGFR 陽性（＋＋或＋＋＋者）NSCLC 的開放、劑量升級的臨床試驗(yàn)。入組19 例中1 例確認(rèn)CR、4 例PR，最常見不良事件為皮疹（89%）。研究認(rèn)為聯(lián)合治療方案可耐受，目前正進(jìn)行進(jìn)一步臨床研究。 

     （三）針對EGFR 的RNA 干擾 <br> 除EGFR-TKIs 和抗EGFR 單克隆抗體外，近年來采用RNA 干擾技術(shù)抑制EGFR 基因表達(dá)的研究也取得了可喜的進(jìn)展。我們研究所利用RNAi 沉默NSCLC 細(xì)胞株中EGFR 表達(dá)后，成功抑制了腫瘤細(xì)胞的生長，并通過體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步論證了靶向EGFR 的RNAi 抗腫瘤活性。 

     采用RNA 干擾技術(shù)，研究肺癌靶向治療的新策略。設(shè)計(jì)針對EGFR 基因的小干擾RNA 特異性序列，正義鏈：5‘-AAGGAGCUGCCCAUGAGAAAU-3‘ ；反義鏈：5‘-AUUUCUCAUGGGCAGCUCC-3‘；并利用化學(xué)合成小干擾RNA 初步驗(yàn)證了其抑制EGFR 基因表達(dá)和肺腺癌細(xì)胞生長的效應(yīng)。

    以此序列為基礎(chǔ)，構(gòu)建靶向EGFR 基因的小發(fā)夾RNA（small hairpin RNA，shRNA）質(zhì)粒表達(dá)載體。利用lipofectamine2000 將pShEGFR 載體轉(zhuǎn)入人肺腺癌細(xì)胞（human lung adenocarcinoma cell，HLAC）A549 和SPC-A1 中。轉(zhuǎn)染后2d，經(jīng)定量PCR 檢測，pShEGFR對A549 和SPC-A1 中EGFR mRNA的抑制率分別達(dá)72.9%和81.0%；經(jīng)免疫印跡檢測，EGFR 蛋白抑制率在轉(zhuǎn)染后6d 最高，在A549 和SPC-A1 中分別達(dá)74.1%和84.6%。質(zhì)粒介導(dǎo)的shRNA 表達(dá)載體可在人肺腺癌細(xì)胞中產(chǎn)生RNAi 效應(yīng)，下調(diào)EGFR mRNA 和蛋白水平的表達(dá)。pShEGFR 對A549 和SPC-A1 細(xì)胞的克隆形成抑制率分別為62.8%和68.9%。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，pShEGFR 使A549 和SPC-A1 細(xì)胞G0/G1 期比例顯著增加，S 期比例顯著下降，并促進(jìn)A549 和SPC-A1 細(xì)胞凋亡；經(jīng)Millcell 小室檢測，pShEGFR 顯著抑制A549 和SPC-A1 細(xì)胞遷移；經(jīng)MTT 法檢測，pShEGFR 可將A549 和SPC-A1 細(xì)胞對順鉑、阿霉素、泰素的敏感性分別提高6.7 和6.0、5.5 和4.7、6.6 和6.4 倍。靶向EGFR 基因的shRNA 質(zhì)粒表達(dá)載體能夠通過下調(diào)EGFR蛋白水平抑制肺腺癌細(xì)胞生長、遷移、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并提高細(xì)胞對不同化療藥物的敏感性。

    將上述靶向EGFR 的小干擾RNA 發(fā)夾DNA 表達(dá)模板與穿梭載體連接。將穿梭載體和骨架載體共轉(zhuǎn)染293 包裝細(xì)胞，制備重組腺病毒（Adv-shEGFR）。Adv-shEGFR 體外感染肺腺癌細(xì)胞A549 和SPC-A1。定量PCR 檢測EGFR 基因mRNA表達(dá)變化：感染Adv-shEGFR 3d 后，對A549，SPC-A1細(xì)胞中EGFR mRNA 水平的抑制率分別達(dá)81.2%和79.8%。Western blot 檢測，感染Adv-shEGFR 3d和6d 后，對A549 細(xì)胞中EGFR 蛋白水平抑制率分別為52.3%和80.2%，對SPC-A1 細(xì)胞中EGFR 蛋白水平抑制率分別為45.5%和85.8%。體外感染病毒后的HLAC 進(jìn)行動(dòng)物接種，感染Adv-shEGFR 的A549，SPC-A1 細(xì)胞體內(nèi)生長能力明顯受到抑制。

    建立A549，SPC-A1 裸鼠移植瘤模型，瘤內(nèi)注射Adv-shEGFR，Western blot 測定腫瘤組織EGFR蛋白表達(dá)的抑制率分別為51.5%和44.8%。測量腫瘤體積繪制生長曲線，記錄腫瘤重量，計(jì)算腫瘤抑制率分別達(dá)62.8%和52.4%。靶向EGFR 的shRNA 重組腺病毒能夠有效實(shí)現(xiàn)動(dòng)物體內(nèi)核酸導(dǎo)入并產(chǎn)生RNAi 效應(yīng)，通過下調(diào)HLAC 中EGFR 的表達(dá)抑制HLAC 的體內(nèi)生長。

    二、以腫瘤血管生成為靶點(diǎn)的治療 

     腫瘤血管生成是腫瘤生長、轉(zhuǎn)移播散過程中極為重要的步驟，因而抗血管生成成為腫瘤藥物開發(fā)和腫瘤靶向治療的熱點(diǎn)。主要包括：以VEGF/VEGFR 為靶點(diǎn)的藥物、以血管內(nèi)皮細(xì)胞為靶點(diǎn)的藥物、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（MMPIs）等。

    （一）以VEGF/VEGFR 為靶點(diǎn)的藥物由于血管內(nèi)皮生長因子及