蔡莉（綜述）　王婭蘭（審校）（重慶醫(yī)科大學(xué)病理教研室　重慶）

　　肝臟是許多惡性腫瘤常見的轉(zhuǎn)移器官之一，單發(fā)的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)可以積極外科手術(shù)治療，但彌漫性的多發(fā)肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)缺乏有效的治療方法。近幾年來免疫治療、基因治療為肝轉(zhuǎn)移腫瘤的治療開辟了新的路徑。而白細(xì)胞介素12（IL-12）被認(rèn)為是細(xì)胞免疫應(yīng)答過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，具有明顯的抗腫瘤活性,已成為腫瘤免疫治療及綜合治療中的熱點(diǎn)。本文就IL-12的基本特征、抗腫瘤肝轉(zhuǎn)移機(jī)制及應(yīng)用的研究作一綜述。

1 IL-12的基本特征  
　　IL-12最早發(fā)現(xiàn)于1989年[1]，當(dāng)時(shí)被稱為NK細(xì)胞刺激因子(natural killer cell stimulatory factor, NKSF)。1990年，由EB病毒轉(zhuǎn)化的另一株B細(xì)胞（NC-37細(xì)胞系）培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)了一種能誘導(dǎo)細(xì)胞毒型淋巴細(xì)胞分化成熟的物質(zhì)，稱為細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞成熟因子（cytotoxic lymphocyte maturation factor，CLMF）。后來的研究證明，NKSF和CLMF的基因序列完全相同，為同一種細(xì)胞因子，統(tǒng)一命名為白細(xì)胞介素12(interleukin 12,IL-12)。
　　IL-12是由分子量分別為40 KD（p40）和35 KD（p30）的兩條肽鏈經(jīng)二硫建共價(jià)連接而成的異二聚體糖蛋白。由于肽鏈上糖基化數(shù)量的變化，異二聚體的分子量變動(dòng)于(70~75)×103之間，多數(shù)為70×103，故常以IL-12 p70表示IL-12的異二聚體形式。IL-12 p70是IL-12發(fā)揮生物學(xué)功能的基本分子結(jié)構(gòu)，游離的p40和p30均不表現(xiàn)任何生物活性。產(chǎn)生IL-l2的細(xì)胞主要有兩大類：一類是參與先天免疫的細(xì)胞，如吞噬細(xì)胞、漿細(xì)胞及角質(zhì)細(xì)胞；另一類是抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)，包括吞噬細(xì)胞的單核／巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）和皮膚郎罕細(xì)胞。
　　IL-12能顯著增強(qiáng)NK細(xì)胞和特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（cytotoxic t lymphocyte，CTL）的細(xì)胞毒活性；促進(jìn)T細(xì)胞、NK細(xì)胞增殖；誘導(dǎo)Thl細(xì)胞的分化；刺激T細(xì)胞及NK細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子,特別是IFN-γ,能激活巨噬細(xì)胞的溶細(xì)胞膜的作用，能誘導(dǎo)干擾素誘導(dǎo)蛋白10(interferon inducible protein 10, IP-10)而發(fā)揮抑制腫瘤血管形成的作用，顯示出其在腫瘤的免疫治療中將起重要作用。

2 IL-12抗腫瘤肝轉(zhuǎn)移的機(jī)制
　　大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，IL-12不僅能抑制腫瘤的生長，而且能抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，延長荷瘤動(dòng)物的生存時(shí)間，但對(duì)IL-l2抗瘤作用在不同腫瘤中的細(xì)胞和分子機(jī)制各家報(bào)道不同。許多研究者發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞是IL-l2抗腫瘤效應(yīng)的必需物質(zhì)。Chen 等[2]則認(rèn)為IL-12的抗瘤作用主要通過CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的抗原特異性IFN-γ分泌增加實(shí)現(xiàn)。van Herpen  CM等 [3]在用重組人IL-12瘤內(nèi)注射治療頭頸部鱗癌患者時(shí)，發(fā)現(xiàn)IL-12的抗瘤效應(yīng)主要與誘導(dǎo)NK細(xì)胞在原發(fā)腫瘤內(nèi)浸潤有關(guān)。而Xu 等[4]證明IL-l2的抗腫瘤效應(yīng)需要NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞共同參與。除腫瘤的免疫機(jī)制外，IL-l2對(duì)宿主內(nèi)皮細(xì)胞有直接的抑制血管生成的作用[5]。
　　對(duì)于IL-12抗腫瘤肝轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，目前也沒有統(tǒng)一的結(jié)論。Kobayashi  [6]將IL-12注射到不同腫瘤分期（晚期伴肝轉(zhuǎn)移）的RL雄性BALB/c荷瘤小鼠模型中，在腫瘤晚期，裸鼠和胸腺正常小鼠的肝轉(zhuǎn)移均被明顯抑制，但I(xiàn)L-12在裸鼠中沒產(chǎn)生抗瘤效應(yīng)。認(rèn)為IL-12介導(dǎo)的抗瘤效應(yīng)主要靠T細(xì)胞，而抗轉(zhuǎn)移效應(yīng)主要靠NK和/或自然殺傷性T細(xì)胞(natural killer T cells，NKT)細(xì)胞, 一種特殊類型的T淋巴細(xì)胞，其除表達(dá)TCR和CD3等T淋巴細(xì)胞特有標(biāo)記外，同時(shí)表達(dá)NK細(xì)胞系所獨(dú)有的抗原受體NK1.1、CD56和抑制性受體Ly49)介導(dǎo)。檢驗(yàn)IL-12對(duì)這些細(xì)胞的直接作用，發(fā)現(xiàn)IL-12誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖在腫瘤早期明顯加強(qiáng)，晚期顯著下降，但I(xiàn)L-12誘導(dǎo)的被NK和NKT細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性在早期和晚期均未減弱，T細(xì)胞和NK和/或NKT細(xì)胞對(duì)IL-12的應(yīng)答性在早期和晚期的不同解釋了IL-12在腫瘤晚期顯著不足的抗轉(zhuǎn)移效應(yīng)。Shin T7則證明IL-12激活的Vα14 NKT 細(xì)胞而不是NK 細(xì)胞的過繼性轉(zhuǎn)移阻止了B16黑素瘤的肝轉(zhuǎn)移，同時(shí)NK細(xì)胞在IL-12介導(dǎo)的抗瘤效應(yīng)中發(fā)揮的作用很小。在Vα14 NKT細(xì)胞介導(dǎo)的抗瘤活性的效應(yīng)期,直接的細(xì)胞毒機(jī)制勝于細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。但Park 等[8]對(duì)NKT細(xì)胞是IL-12介導(dǎo)的腫瘤排斥反應(yīng)系統(tǒng)的必需細(xì)胞的觀點(diǎn)提出了挑戰(zhàn)，認(rèn)為IL-12介導(dǎo)的腫瘤排斥反應(yīng)機(jī)制復(fù)雜，與不同腫瘤所處的特定微環(huán)境有關(guān)。他們檢測(cè)和對(duì)比了經(jīng)外源性IL-12給藥后NKT細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞和其他γ-鏈依賴的非T非B細(xì)胞對(duì)小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞的排斥作用，結(jié)果不支持NKT細(xì)胞在IL-12介導(dǎo)的腫瘤排斥反應(yīng)中的必要作用，卻證實(shí)了NK細(xì)胞介導(dǎo)了肝轉(zhuǎn)移的排斥反應(yīng)，這與肝臟內(nèi)NK細(xì)胞的高頻率分布及其功能是一致的。
　　近幾年來，用重組腺病毒載體將IL-12基因轉(zhuǎn)移到肝細(xì)胞已被證明在小鼠中能抑制原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性肝臟腫瘤，但抑制機(jī)制不明確。有研究[9]認(rèn)為攜帶IL-12基因的腺病毒（adenovirus encoding IL-12,AdIL-12）抗肝轉(zhuǎn)移的抗瘤活性不依賴T細(xì)胞、NK細(xì)胞及NKT細(xì)胞，但在Miller等 [10]的實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)AdIL-12治療的NK細(xì)胞失活的小鼠血清IL-12水平比NK細(xì)胞正常的小鼠升高了250倍,轉(zhuǎn)基因表達(dá)延長了接近兩周。分離這些經(jīng)AdIL-12治療后動(dòng)物的NK細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)它們以溶解活性和IFN-γ分泌的方式被激活。將這種NK細(xì)胞過繼性轉(zhuǎn)移到未接受過治療的荷瘤小鼠身上，也明顯抑制了結(jié)腸直腸癌的肝轉(zhuǎn)移。表明AdIL-12抑制結(jié)腸直腸癌的肝轉(zhuǎn)移除了部分通過NK細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ介導(dǎo)外，內(nèi)生性IL-12的過度表達(dá)激活NK細(xì)胞亦參與了抗轉(zhuǎn)移過程。

3 IL-12抗腫瘤肝轉(zhuǎn)移的應(yīng)用
　　IL-12在多種臨床前期動(dòng)物模型中都表現(xiàn)出了抗腫瘤作用，但在體內(nèi)使用IL-12有較大毒性反應(yīng)。而用IL-12基因工程疫苗治療肝轉(zhuǎn)移毒副作用較小，成為目前研究的熱點(diǎn)，根據(jù)IL-12免疫基因治療的給藥途徑和方法主要分為體內(nèi)基因治療、原位基因治療和離體基因治療：
　　3.1 體內(nèi)基因治療 
　　體內(nèi)基因治療是將目的基因載體注射到血液系統(tǒng)進(jìn)行全身性基因治療。病毒載體傳遞法是最有效的傳遞重組基因至體細(xì)胞的方法之一。目前最常用的載體為重組逆轉(zhuǎn)錄病毒和重組腺病毒。
　　　　3.1.1 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒   Alves 等 [11] 用單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV1-TK) 或更昔洛韋 (GCV)聯(lián)合攜帶IL-12基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒治療大鼠DHDK12 結(jié)腸癌的多灶性肝轉(zhuǎn)移模型,不僅觀察到腫瘤體積明顯縮小,而且大鼠存活率顯著提高。在部分肝切除術(shù)后顯微鏡下有DHDK12復(fù)發(fā)的大鼠模型中，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的IL-12基因治療后,再發(fā)腫瘤體積顯著縮小，生存率也明顯提高。這說明IL-12作為基因治療的佐劑有助于可切除或不可切除患者的治療。
　　　　3.1.2 重組腺病毒  有研究表明通過AdIL-12和抗-4-1BB的聯(lián)合治療可以根除小鼠結(jié)腸癌的肝轉(zhuǎn)移，但此療法對(duì)腫瘤面積大于8 mm× 8 mm的小鼠療效不佳。Pan等  [12]證明了活體內(nèi)OX40與 CD4+T 細(xì)胞的結(jié)合誘導(dǎo)了在經(jīng)AdIL-12、抗-4-1BB和抗-OX40聯(lián)合治療的大瘤負(fù)荷小鼠身上更高的CTL反應(yīng)。該聯(lián)合治療得到的小鼠存活率比僅用AdIL-12與抗-4-1BB聯(lián)合治療的高，其長期存活的小鼠顯示了更高的對(duì)抗親代腫瘤的記憶性CTL反應(yīng)。因此，用AdIL-12+抗-4-1BB+抗-OX40的聯(lián)合治療可能為與免疫抑制或耐受有關(guān)的晚期癌癥患者提供了一個(gè)更好的治療模式。
　　　　許多臨床前試驗(yàn)表明低劑量的IL-12使CTL反應(yīng)成為可能，但高劑量的人IL-12的重組體(recombinant human IL-12 ，rhIL-12)有明顯的毒力。Cebon 等[13]尋找并測(cè)定了rhIL-12與抗原肽聯(lián)合治療在更低劑量時(shí)的最佳生物劑量：在受試者為通過RT-PCR 或免疫組織化學(xué)表達(dá)黑素-A(Melan-A)來評(píng)價(jià)的III 或 IV期黑素瘤患者中，以10~100 ng/kg的劑量經(jīng)皮下或靜脈注射的rhIL-12能被耐受。但近年來更多研究傾向于IL-12基因疫苗在腫瘤的局部應(yīng)用。
　　3.2 原位基因治療  原位基因治療是將目的基因載體直接注射或?qū)塍w內(nèi)的腫瘤組織，進(jìn)行局部性基因治療。它因在增強(qiáng)局部腫瘤免疫反應(yīng)使腫瘤消退的同時(shí)不會(huì)導(dǎo)致循環(huán)中高濃度IL-12而優(yōu)于全身用藥。Jarnagin [14]用直接瘤內(nèi)注射NV1042（一種有溶瘤細(xì)胞活性的載有IL-12基因的單純皰疹病毒復(fù)制品）的方法治療所建立的腫瘤模型，不僅使母瘤體積縮小，而且明顯降低了母瘤切除術(shù)后肝再發(fā)腫瘤的數(shù)量和再次給藥量。Gao等[15]將攜帶IL-12編碼的纖維-突變體腺病毒載體（IL-12-encoding fiber-mutant adenoviral vector ，AdRGD-IL-12）單次小劑量（2× 107 空斑形成單位）注射入Meth-A纖維肉瘤（對(duì)IL-12的全身用藥不敏感）小鼠的瘤內(nèi)，誘導(dǎo)了明顯的抗瘤活性，并使該荷瘤小鼠的生存率顯著延長。免疫組織化學(xué)染色表明AdRGD-IL-12誘導(dǎo)了瘤組織內(nèi)T細(xì)胞的聚集，且病毒載體瘤內(nèi)給藥誘導(dǎo)的抗轉(zhuǎn)移效應(yīng)與對(duì)抗同源腫瘤長期的特異性免疫一樣好。
　　3.3 離體基因治療 
　　立體基因治療是將目的基因在體外導(dǎo)入自體或異體來源的腫瘤細(xì)胞，免疫細(xì)胞或其他細(xì)胞，再將這些修飾過的靶細(xì)胞轉(zhuǎn)入體內(nèi)。
　　DC是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)大的APC，也是分泌IL-12的細(xì)胞之一。由DC激活的細(xì)胞免疫，特別是CTL介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，在機(jī)體抵御惡性腫瘤中發(fā)揮著十分重要的作用。Satoh等 [16]直接將IL-12 基因轉(zhuǎn)染的DC注入門靜脈明顯抑制了C57BL/6小鼠模型MC38結(jié)腸癌在肝臟的生長，并伴有CD4+、CD8+和NLDC-145+免疫效應(yīng)細(xì)胞的瘤內(nèi)蓄積，還導(dǎo)致了全身免疫反應(yīng)，這種反應(yīng)是由從脾和引流淋巴結(jié)分離的T淋巴細(xì)胞引起的IFN-γ分泌增強(qiáng)誘導(dǎo)的。對(duì)Cy3-標(biāo)記的DC隨門靜脈灌注歸巢的評(píng)價(jià)證實(shí)了他們?cè)诟闻K和淋巴組織的分布。所以IL-12 基因轉(zhuǎn)染的DC的局部給藥不僅能在活體內(nèi)抑制結(jié)腸直腸癌在肝臟的生長，而且能激發(fā)全身性抗瘤免疫反應(yīng)。這條途徑很可能提高結(jié)腸直腸癌轉(zhuǎn)移的免疫治療效果,因?yàn)槟[瘤相關(guān)DC的數(shù)量與更好的預(yù)后成正相關(guān)。同時(shí)局部基因治療將進(jìn)一步提高臨床功效,使患者不用冒全身中毒的危險(xiǎn)。
　　為獲得IL-12在腫瘤部位的局部表達(dá)而